本研究揭示MAP3K3通過TAL1/JAM-A 信號通路調(diào)控髓系細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移（滲出），在心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）中發(fā)揮關(guān)鍵作用：MI/RI 患者和小鼠模型中，髓系細(xì)胞的 MAP3K3 表達(dá)顯著上調(diào)且與損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)，髓系細(xì)胞特異性敲除 Map3K3 可通過增強(qiáng) TAL1 對 F11r（編碼 JAM-A）的轉(zhuǎn)錄抑制、減少整合素內(nèi)化，降低髓系細(xì)胞滲出并減輕 MI/RI；Pazopanib（MAP3K3 抑制劑）通過阻斷 MAP3K3 的磷酸化活性，抑制 TAL1 泛素化降解和 JAM-A 表達(dá)，減少髓系細(xì)胞滲出，顯著改善 MI/RI，為 MI/RI 及相關(guān)炎癥疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。

研究臨床背景

       急性心肌梗死（MI）后早期血供恢復(fù)可減少心肌細(xì)胞損失，但繼發(fā)性心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）仍嚴(yán)重威脅心功能；髓系細(xì)胞（單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）滲出是 MI/RI 炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，通過釋放促炎因子加劇心肌損傷，但該過程的上游調(diào)控通路尚未wan全明確。

核心分子

       MAP3K3：絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，參與 MAPK、NF-κB 等通路，在炎癥和心血管疾病中起作用，但在髓系細(xì)胞滲出中的功能未知。TAL1：轉(zhuǎn)錄因子，參與造血細(xì)胞生成，其在髓系細(xì)胞滲出中的作用未明確。JAM-A：由 F11r 編碼，調(diào)控整合素內(nèi)化和白細(xì)胞脫黏附，缺失可減少缺血再灌注損傷中的白細(xì)胞滲出。

研究目的

       闡明 MAP3K3 在 MI/RI 髓系細(xì)胞滲出中的作用及分子機(jī)制，評估其作為治療靶點(diǎn)的潛力。

結(jié)果

臨床樣本：MI/RI 患者外周血單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中 MAP3K3 的 mRNA 和蛋白水平顯著高于對照組（P<0.05），且與 CK-MB（單核 / 中性粒細(xì)胞）、LDH（單核 / 中性粒細(xì)胞）、cTn特（單核細(xì)胞）等心臟標(biāo)志物正相關(guān)（r 值范圍 0.3-0.5，P<0.05）。
動物模型：小鼠 MI/RI 術(shù)后，心臟髓系細(xì)胞（CD45+Ly6G + 中性粒細(xì)胞、CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C + 單核細(xì)胞）的 MAP3K3 表達(dá)在術(shù)后 3 天達(dá)峰值，顯著高于對照組（P<0.01）。

圖 1 心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）期間髓系細(xì)胞中 MAP3K3 表達(dá)上調(diào)且與心臟標(biāo)志物相關(guān)。

對 GSE123342 數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定型冠心?。–AD）患者相比，MI 患者外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中 MAP3K3 表達(dá)水平顯著上調(diào)。在人類缺血性心肌病（ICM）左心室組織中（GSE57338 數(shù)據(jù)集），MAP3K3 表達(dá)也呈上調(diào)趨勢（圖 1B）。在 MI/RI 患者的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中分別驗(yàn)證了 MAP3K3 的上調(diào)表達(dá)（圖 1C-E）。MI/RI 患者中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中 MAP3K3 表達(dá)水平與血清心臟標(biāo)志物 （包括 CK-MB、cTn特、LDH、pro-BNP、CRP、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6））及血常規(guī)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中 MAP3K3 的 mRNA 表達(dá)水平與 CK-MB、LDH 呈正相關(guān)，而單核細(xì)胞中 MAP3K3 的 mRNA 表達(dá)水平還與 cTn特 呈正相關(guān)（圖 1F-G）。

圖 2 髓系細(xì)胞特異性 Map3k3 缺陷可減輕心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）并減少髓系細(xì)胞向心臟的浸潤

構(gòu)建髓系細(xì)胞特異性 Map3k3 缺陷（Map3k3CKO）小鼠，并在 Map3k3CKO 小鼠和 Map3k3fl/fl 小鼠中建立 MI/RI 模型。髓系細(xì)胞中 Map3k3 缺陷可改善心臟功能，表現(xiàn)為左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）升高（圖 2A-B），且梗死面積縮?。▓D 2C-D）。對 MI/RI 組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞中 Map3k3 缺陷可減少心肌組織中髓系細(xì)胞的浸潤（圖 2E ）。

圖 3 髓系細(xì)胞特異性 Map3k3 缺陷可減少心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）后髓系細(xì)胞從骨髓的跨內(nèi)皮遷移及體內(nèi)跨內(nèi)皮遷移過程

為進(jìn)一步闡明 Map3k3 缺陷對髓系細(xì)胞遷移的影響，我們對 MI/RI 小鼠進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，Map3k3CKO 小鼠心臟中浸潤的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例均降低（圖 3A-B ）。追溯髓系細(xì)胞的遷移路徑發(fā)現(xiàn)，Map3k3CKO 小鼠血液中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例降低（圖 3C-D ），而骨髓中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例升高（圖 3E-F ）。將來自 Map3k3CKO 小鼠或 Map3k3fl/fl 小鼠骨髓的標(biāo)記髓系細(xì)胞混合物注入循環(huán)系統(tǒng)，2.5 小時后檢測腹腔和血液中兩種髓系細(xì)胞群體的比例（圖 3G）。所有混合物在血液中的標(biāo)記比例略有差異，證實(shí)了 1:1 的混合比例且注射過程無影響。在腹腔中，無論使用何種染料標(biāo)記，Map3k3CKO 小鼠的髓系細(xì)胞比例均降低。而當(dāng)髓系細(xì)胞直接注入腹腔時，兩種小鼠的髓系細(xì)胞比例無顯著差異（圖 3H）。

心功能改善：Map3k3CKO 小鼠 MI/RI 術(shù)后 3 天的 LVEF（58.2%±2.1% vs 45.3%±1.8%）和 LVFS（30.1%±1.2% vs 22.5%±1.0%）顯著高于 Map3k3fl/fl 小鼠（P<0.01）。
損傷減輕：梗死面積（IR/AAR）從 Map3k3fl/fl 小鼠的 45.2%±3.1% 降至 Map3k3CKO 小鼠的 28.6%±2.5%（P<0.01），心肌細(xì)胞凋亡率（TUNEL 陽性率）降低 35%±4%（P<0.01）。
滲出抑制：Map3k3CKO 小鼠心臟中髓系細(xì)胞浸潤比例降低 40%±5%（P<0.01），血液中髓系細(xì)胞比例降低 25%±3%（P<0.05），骨髓中髓系細(xì)胞比例升高 30%±4%（P<0.01），提示髓系細(xì)胞從骨髓到血液的滲出受阻。

圖4 髓系細(xì)胞特異性 Map3k3 缺陷可增強(qiáng) TAL1 對 F11r 的轉(zhuǎn)錄抑制功能

測序結(jié)果顯示，Map3k3CKO 小鼠中，多種黏附相關(guān)基因（如 Itgb3、Adgre4、Itgax）表達(dá)上調(diào)，而脫黏附基因 F11r 表達(dá)下調(diào)（圖 4A-B）。黏附與遷移通路的基因本體（GO）分析顯示，Map3k3CKO 小鼠中黏附相關(guān)術(shù)語的基因富集度升高，遷移相關(guān)基因的富集度降低（圖 4C）。KEGG通路 “細(xì)胞黏附分子"（mmu04514）的基因分析顯示，Itgb3 和 Itgax 表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)11r 表達(dá)下調(diào)（圖 4D）。由于 F11r 的表達(dá)變化發(fā)生在 RNA 水平，我們追溯其轉(zhuǎn)錄因子，鑒定出四個可能參與 F11r 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的候選轉(zhuǎn)錄因子：TAL1、PRDM1、PPARG 和 PBX1（圖 4E）。在四個候選轉(zhuǎn)錄因子中，僅 TAL1 在 Map3k3CKO 細(xì)胞中的磷酸化水平降低，且特異性發(fā)生在 S122 和 S172 位點(diǎn)（圖 4F）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，TAL1 主要抑制 F11r 的轉(zhuǎn)錄（圖 4G。在 MI/RI 小鼠血液的髓系細(xì)胞中觀察到 MAP3K3 和 JAM-A 表達(dá)升高，而 TAL1 表達(dá)受到抑制（圖 ）。在 Map3k3CKO 小鼠中，上述表達(dá)模式發(fā)生逆轉(zhuǎn)（圖 4I ）。體外實(shí)驗(yàn)中，單核細(xì)胞趨化因子 MCP-1 刺激骨髓髓系細(xì)胞后，MAP3K3 和 JAM-A 表達(dá)升高，TAL1 表達(dá)降低；而 Map3k3CKO 小鼠的細(xì)胞或經(jīng)帕唑帕尼（MAP3K3 激酶抑制劑 ）處理的細(xì)胞中，TAL1 表達(dá)升高，JAM-A 表達(dá)受到抑制（圖 4J）。在 293T 細(xì)胞中（圖 4K），過表達(dá) TAL1 可逆轉(zhuǎn) MAP3K3 過表達(dá)介導(dǎo)的 JAM-A 上調(diào)（圖 4L ）；而敲低 TAL1 可逆轉(zhuǎn) Map3k3 敲除或帕唑帕尼處理介導(dǎo)的 JAM-A 下調(diào)（圖 4M-N ）。反向?qū)嶒?yàn)證實(shí)，MAP3K3 通過下調(diào)其抑制性轉(zhuǎn)錄因子 TAL1，上調(diào) F11r 的表達(dá)。由于帕唑帕尼與 Map3k3 敲除具有相似的作用效果，該機(jī)制可能依賴于 MAP3K3 的激酶活性。

圖 5 Map3k3 缺陷通過 JAM-A 以磷酸化依賴的方式增強(qiáng)髓系細(xì)胞黏附并減少跨內(nèi)皮遷移

與 Map3k3fl/fl 小鼠的髓系細(xì)胞相比，Map3k3CKO 小鼠的髓系細(xì)胞在整個時間進(jìn)程中的遷移功能均受損（圖 5A-D）。同時，與未處理或 IgG1 處理的細(xì)胞相比，經(jīng) JAM-A 抗體或帕唑帕尼處理的細(xì)胞遷移能力也降低（圖 5A、E-F）。然而，在黏附實(shí)驗(yàn)中，Map3k3CKO 小鼠的髓系細(xì)胞黏附能力增強(qiáng)（圖 5G-I）。

圖 6 MAP3K3 通過在絲氨酸 122（Ser-122）位點(diǎn)磷酸化 TAL1，誘導(dǎo)其蛋白酶體依賴的降解

蛋白酶體抑制劑 MG132 可有效減少 MAP3K3 過表達(dá)介導(dǎo)的 TAL1 降解（圖 6A）；而使用環(huán)己酰亞胺（CHX）抑制蛋白合成后發(fā)現(xiàn)，MAP3K3 過表達(dá)可加速 TAL1 蛋白降解，Map3k3 敲除可增加 TAL1 蛋白穩(wěn)定性（圖 6B-C）。這些結(jié)果表明，MAP3K3 通過誘導(dǎo) TAL1 的蛋白酶體依賴降解來減少 TAL1 的表達(dá)。MAP3K3 過表達(dá)可增加泛磷酸化抗體檢測到的 TAL1 磷酸化水平，并促進(jìn) TAL1 的泛素化；T90A 突變對 TAL1 的磷酸化和泛素化無顯著影響，而 S172A 突變和 S122A 突變可顯著降低 TAL1 的磷酸化和泛素化水平。我們進(jìn)一步將 Ser-122 或 Ser-172 位點(diǎn)突變?yōu)楣劝彼幔‥）以模擬磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn) Map3k3 敲除可降低 TAL1 的磷酸化和泛素化水平，而 S122E 或 S172E 突變可維持 TAL1 的泛素化水平（圖 6D）。為明確 MAP3K3 對 TAL1 的直接磷酸化作用，我們進(jìn)行了體外激酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) MAP3K3 可直接磷酸化 TAL1 的 Ser-122 位點(diǎn)（圖 6E）。S122A 突變可減少 TAL1 的降解，而 S122E 突變可加速 TAL1 的降解，且這種加速降解可被 MG132 逆轉(zhuǎn)（圖 6F）。使用 CHX 抑制蛋白合成后發(fā)現(xiàn)，S122E 突變可加速 TAL1 蛋白降解，而 S122A 突變可增加 TAL1 蛋白穩(wěn)定性（圖 6G-H）。Map3k3CKO 小鼠的細(xì)胞或經(jīng)帕唑帕尼處理的細(xì)胞中，TAL1 的磷酸化水平降低，穩(wěn)定性增加（圖 6I）。在 293T 細(xì)胞系中也觀察到了相同的現(xiàn)象（圖 6J）。在 MI/RI 小鼠血液的髓系細(xì)胞中，p-TAL1（S122）的表達(dá)水平升高（圖 6K）；而在 Map3k3CKO 小鼠中，該表達(dá)模式發(fā)生逆轉(zhuǎn)（圖 6L）。

心功能與損傷：Pazopanib 處理組小鼠的 LVEF（56.8%±2.0% vs 44.9%±1.9%）、LVFS（29.5%±1.1% vs 22.3%±1.1%）顯著高于生理鹽水組（P<0.01），梗死面積（IR/AAR）從 44.8%±3.0% 降至 30.2%±2.6%（P<0.01）。
滲出抑制：Pazopanib 處理后，心臟、血液中髓系細(xì)胞比例分別降低 38%±4%、23%±3%（P<0.01），骨髓中髓系細(xì)胞比例升高 28%±3%（P<0.01），與 Map3k3CKO 小鼠表型一致。

圖 7 帕唑帕尼通過降低 MAP3K3 的磷酸化活性及髓系細(xì)胞從骨髓的跨內(nèi)皮遷移，改善心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）

帕唑帕尼治療可改善 MI/RI，表現(xiàn)為 LVEF 和 LVFS 升高（圖 7A-B）、梗死面積縮小（圖 7C-D）以及 TUNEL 染色顯示的心肌細(xì)胞凋亡減少。對 MI/RI 小鼠的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，帕唑帕尼治療可減少中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞從骨髓向心臟（圖 7E-F）和血液（圖 7G-H）的遷移（圖 7I-J）。

研究結(jié)論與意義

核心結(jié)論：MAP3K3 通過磷酸化 TAL1（Ser-122）促進(jìn)其泛素化降解，解除對 F11r 的轉(zhuǎn)錄抑制，上調(diào) JAM-A 表達(dá)，增強(qiáng)整合素內(nèi)化，最終促進(jìn)髓系細(xì)胞脫黏附和滲出，加劇 MI/RI。

臨床意義：Pazopanib（低劑量、短期給藥）可通過抑制 MAP3K3 活性，阻斷上述通路，減少髓系細(xì)胞滲出，為 MI/RI 及其他炎癥相關(guān)疾病（如膿毒癥）提供了新的治療策略。